Nucleofection-Based CRISPR/Cas Delivery in Human T Cells for Immunotherapy Applications.

چکیده اصلی

Electroporation-based delivery of CRISPR/Cas systems has emerged as a powerful and versatile approach for gene editing in primary human T cells, enabling efficient, transient, and nonviral modification while minimizing genomic integration risks. This chapter focuses on the principles and practical implementation of electroporation (nucleofection) for the delivery of Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes into human T cells, highlighting critical parameters that influence editing efficiency, cell viability, and scalability for research and clinical applications. We provide a comprehensive protocol for multiplex gene editing in primary human T cells using Cas9 RNP electroporation, including optimization of cell activation status, buffer composition, electroporation settings, and post-electroporation recovery. Particular emphasis is placed on strategies to achieve high-efficiency disruption of target loci such as TRAC and B2M, enabling the generation of edited T cell products with defined functional properties. As a representative application, we describe how this delivery platform can be integrated with chimeric antigen receptor (CAR) engineering to produce edited CAR-T cells, including universal "off-the-shelf" designs with reduced risks of graft-versus-host disease and immune rejection. Downstream evaluation methods, including multiparameter flow cytometry for assessing editing efficiency and immunophenotype, are also outlined.

ترجمه فارسی چکیده

الکتروپوراسیون به عنوان یک رویکرد قدرتمند و چندمنظوره برای ویرایش ژن در سلول‌های T انسانی اولیه ظهور کرده است که امکان اصلاح مؤثر، موقت و غیرویروسی را فراهم می‌کند و ریسک‌های ادغام ژنومیک را کاهش می‌دهد. این فصل بر اصول و پیاده‌سازی عملی الکتروپوراسیون (نکلئوفکشن) برای انتقال پیچیدگی‌های پروتئین‌های رنوکلیوئیدی (RNP) کاس۹ به سلول‌های T انسانی تمرکز دارد و پارامترهای حیاتی که بر کارایی ویرایش، زنده‌مانی سلول و مقیاس‌پذیری تأثیر می‌گذارند را برجسته می‌کند. ما یک پروتکل جامع برای ویرایش چندگانه ژن در سلول‌های T انسانی اولیه با استفاده از الکتروپوراسیون RNP کاس۹ ارائه می‌دهیم، شامل بهینه‌سازی وضعیت فعال‌سازی سلول، ترکیب بفر، تنظیمات الکتروپوراسیون و بازسازی پس از الکتروپوراسیون. تأکید ویژه‌ای بر استراتژی‌های برای دستیابی به اختلال با کارایی بالا در محل‌های هدف مانند TRAC و B2M قرار دارد که امکان تولید محصولات سلولی ویرایش‌شده با ویژگی‌های عملکردی مشخص را فراهم می‌کند. به عنوان یک کاربرد نمونه، ما توصیف می‌کنیم که این پلتفرم انتقال می‌تواند با مهندسی گیرنده آنتی‌ژن شبه‌ای (CAR) ادغام شود تا سلول‌های CAR-T ویرایش‌شده را تولید کند، شامل طراحی‌های «آماده‌سازی شده» جهانی با ریسک‌های کمتر بیماری گراون-درابر-میزوست و ردیت ایمنی. روش‌های ارزیابی پایین‌دست، از جمله سیالاتومتری چندپارامتری برای ارزیابی کارایی ویرایش و پرفنوتیپ ایمنی، نیز خلاصه شده‌اند.

متن کامل اصلی