An Electroporation-Based Protocol for Ex Vivo Base Editing: From Design to Quantitative Assessment.

چکیده اصلی

Base editing is a CRISPR variant approach that enables single-nucleotide conversions without generating double-strand breaks. Cytosine and adenine base editors mediate C•G to T•A and A•T to G•C transitions, respectively, by coupling a deaminase to a catalytically impaired Cas9, a modified nuclease that lacks DNA cleavage activity but retains DNA binding capability. By avoiding double-strand breaks, base editing limits reliance on unpredictable end-joining pathways and facilitates more precise outcomes. This chapter provides a practical protocol for base editing by electroporation in adherent and suspension stem cells. The workflow spans guide design aligned with the editor activity window, in vitro synthesis of mRNA-based editor components, and electroporation for transient delivery. We detail essential steps for cell handling and recovery, followed by standard readouts. Analytical endpoints focus on targeted sequencing to quantify base conversion and assess editing specificity, with guidance for basic interpretation of results. Troubleshooting notes address frequent pitfalls and practical remedies to optimize performance across cell types.

ترجمه فارسی چکیده

ویرایش پایه یک رویکرد متغیر CRISPR است که بدون ایجاد شکستگی دو رشته‌ای، تبدیل‌های تک‌نوکلئوتیدی را ممکن می‌سازد. ویرایشگرهای سیتوزین و آدنین، ترانزیشن‌های C•G به T•A و A•T به G•C را به ترتیب از طریق اتصال یک دئامیناز به یک Cas9 دارای فعالیت کاتالیتیک آسیب‌دیده، که یک آنزیم برش‌دهنده DNA اصلاح‌شده است که فعالیت برش DNA را از دست داده اما قابلیت اتصال DNA را حفظ کرده است، می‌رسانند. با جلوگیری از شکستگی‌های دو رشته‌ای، ویرایش پایه وابستگی به مسیرهای اتصال غیرقابل پیش‌بینی را محدود می‌کند و نتایج دقیق‌تری را تسهیل می‌کند. این فصل یک پروتکل عملی برای ویرایش پایه از طریق الکتروپوریشن در سلول‌های بنیادی چسبنده و معلق ارائه می‌دهد. جریان کار شامل طراحی راهنما که با پنجره فعالیت ویرایشگر همسو است، سنتز درون‌کیسه‌ای مولکول‌های RNA مبتنی بر مولفه‌های ویرایشگر، و الکتروپوریشن برای تحویل موقت است. ما مراحل ضروری برای مدیریت و بازیابی سلول را با خوانش‌های استاندارد بعدی جزئی می‌کنیم. نقاط پایانی تحلیلی بر روی توالی‌یابی هدفمند برای کمی‌سازی تبدیل پایه و ارزیابی تخصص ویرایش تمرکز دارند و راهنمایی‌هایی برای تفسیر اولیه نتایج ارائه می‌دهند. یادداشت‌های عیب‌یابی به چالش‌های متداول و راهکارهای عملی برای بهینه‌سازی عملکرد در انواع سلولی می‌پردازند.

متن کامل اصلی