Electroporation for High-Efficiency Delivery of CRISPR to Hematopoietic Cells.

چکیده اصلی

Recent advances in genome editing technologies have enabled transformative therapeutic strategies for hematological disorders. Efficient implementation of these approaches requires reliable delivery of genome editing components into primary hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), which are particularly sensitive and resistant to conventional transfection methods. Electroporation has emerged as the most widely used strategy for ex vivo delivery of genome editing reagents into CD34⁺ hematopoietic cells. Genome editing tools can be delivered in multiple formats, including plasmid DNA, messenger RNA (mRNA), and ribonucleoprotein (RNP) complexes. In HSPCs, mRNA- and RNP-based approaches are generally better tolerated than plasmid DNA and allow transient expression with reduced cytotoxicity. In this chapter, we describe optimized protocols for electroporation-based delivery of CRISPR/Cas9 RNP complexes and mRNA-encoded base editors into HSPCs using the Amaxa™ 4D-Nucleofector™ system. Detailed procedures are provided for cell preparation, guide RNA design, assembly of Cas9 RNPs, in vitro transcription and purification of base editor mRNA, electroporation parameters, and assessment of editing efficiency. Emphasis is placed on maximizing editing performance while preserving stem cell viability and functionality.

ترجمه فارسی چکیده

پیشرفت‌های اخیر در فناوری‌های ویرایش ژن منجر به استراتژی‌های درمانی مبتنی بر ویرایش ژن برای اختلالات خونی شده است. پیاده‌سازی مؤثر این رویکردها نیازمند انتقال قابل اعتماد اجزای ویرایش ژن به سلول‌های بنیادی و پیش‌ساز خونی (HSPC) است که به دلیل حساسیت و مقاومت به روش‌های انتقال معمول، دشوار هستند. الکتروپوریشن به عنوان رایج‌ترین استراتژی برای انتقال خارج از بدن مواد ویرایش ژن به سلول‌های خونی CD34⁺ ظهور کرده است. ابزارهای ویرایش ژن می‌توانند در قالب‌های مختلفی از جمله DNA پلاسمیدی، پیام‌RNA (mRNA) و کمپلکس‌های RNP ارائه شوند. در HSPC، رویکردهای مبتنی بر mRNA و RNP به طور کلی تحمل بهتری نسبت به DNA پلاسمیدی دارند و بیان موقت با کاهش سمیت سلولی را امکان‌پذیر می‌کنند. در این فصل، پروتکل‌های بهینه‌شده برای الکتروپوریشن انتقال کمپلکس‌های RNP CRISPR/Cas9 و mRNA کدگذاری‌شده ویرایشگر پایه به HSPC با استفاده از سیستم Amaxa™ 4D-Nucleofector™ توصیف شده است. مراحل دقیقی برای آماده‌سازی سلول، طراحی RNA راهنما، مونتاژ RNP‌های Cas9، ترنسکریپت درون‌تنی و پالایش mRNA ویرایشگر پایه، پارامترهای الکتروپوریشن و ارزیابی کارایی ویرایش ارائه شده است. تأکید بر حداکثر کردن عملکرد ویرایش در حالی که حفظ پایداری و عملکرد سلول‌های بنیادی انجام شده است.

متن کامل اصلی