Methods for Identifying Type III Secretion System Effectors in Chlamydia trachomatis.

چکیده اصلی

To subvert host defenses and establish a replicative niche, obligate intracellular pathogens remodel the host cell using a discrete repertoire of effector proteins. For Chlamydia trachomatis, defining the repertoire of conventional type III secretion system effectors (cT3SS) has been exceedingly difficult as many of these proteins are present at low levels in the host cell and do not accumulate within a specific host compartment, necessitating signal amplification for accurate detection. Drawing on approaches widely used for assessing secretion of candidate T3SS and T4SS substrates, several enzymatic reporter tags have been adapted to evaluate secretion of putative C. trachomatis cT3SS substrates. Here we describe BlaM, CyaA, and GSK assays, which are three complementary assays that provide robust and reliable readouts of effector delivery into the host cell. This protocol describes each assay in detail, including the steps required to generate C. trachomatis transformants, confirm effector-reporter expression, and execute and analyze data for each assay.

ترجمه فارسی چکیده

برای سرکوب دفاع‌های میزبان و ایجاد ناحیه تکثیر، عوامل بیماری‌زا اجباری داخل‌سلولی با استفاده از مجموعه‌ای از پروتئین‌های اثرگذار، سلول میزبان را بازطراحی می‌کنند. برای کلامیدیا تراچوماتیس، تعیین مجموعه اثرگذاران سیستم ترشح نوع III کلاسیک (cT3SS) بسیار دشوار بوده است، زیرا بسیاری از این پروتئین‌ها در سطح پایینی در سلول میزبان وجود دارند و در یک کیسه میزبان خاص تجمع نمی‌کنند و نیاز به تقویت سیگنال برای تشخیص دقیق دارند. با استفاده از رویکردهایی که برای ارزیابی ترشح زیرساخت‌های احتمالی T3SS و T4SS استفاده می‌شود، چندین برچسب گزارش‌گر آنزیمی برای ارزیابی زیرساخت‌های احتمالی cT3SS کلامیدیا تراچوماتیس تطبیق داده شده‌اند. در اینجا ما آزمون‌های BlaM، CyaA و GSK را که سه آزمون مکمل هستند که خروجی‌های قوی و قابل اعتمادی از تحویل اثرگذار به سلول میزبان ارائه می‌دهند، توصیف می‌کنیم. این پروتکل هر آزمون را به تفصیل توصیف می‌کند، شامل مراحل مورد نیاز برای تولید ترانسفورمونت‌های کلامیدیا تراچوماتیس، تأیید بیان اثرگذار-گزارش‌گر و اجرا و تحلیل داده‌های هر آزمون.

متن کامل اصلی