Analysis of Spatial Gene Expression in Chlamydia Using Fluorescent In Situ Hybridization.

چکیده اصلی

The obligate intracellular bacterium Chlamydia employs a unique, asynchronous biphasic developmental cycle characterized by distinct morphological forms: the replicative reticulate body (RB), the infectious elementary body (EB), and an intermediate body (IB). The simultaneous presence of these phenotypically distinct cell types throughout infection complicates the study of gene expression regulation during development. Conventional population-level assays are inadequate for dissecting the regulatory mechanisms within this mixed population. This chapter describes a robust method utilizing hybridization chain reaction (HCR) RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) in conjunction with dual-promoter reporter Chlamydia strains to determine cell-form-specific transcript expression. We leverage dual-reporter strains to provide visual identification of RBs and EBs. Probes targeting genes of interest are designed to interact with spectrally distinct fluorescent HCR amplifiers. This versatile, multiplexing system allows for precise spatial and temporal localization of specific mRNAs within identified Chlamydial cell forms, offering a powerful tool to overcome current limitations in Chlamydia research and elucidate the regulatory underpinnings of its complex life cycle.

ترجمه فارسی چکیده

کلامیدیا، باکتری انگل سلولی اجباری، یک چرخه تکاملی دو فازی غیرهمگام و منحصر به فرد با اشکال مورفولوژیک متمایز (بدن رتیکولات RB، بدن اولیه EB و بدن واسط IB) دارد. همزمانی این انواع سلولی در طول عفونت، مطالعه تنظیم بیان ژن را پیچیده می‌کند. آزمون‌های سطح جمعیت سنتی برای بررسی مکانیسم‌های تنظیم در این جمعیت آمیخته کافی نیستند. این فصل روشی مقاوم را توصیف می‌کند که از هیبریداسیون زنجیره‌ای (HCR) و فلوئورسنت در محل (FISH) همراه با استرهای گزارشگر دو پروموتر برای تعیین بیان ترنسکریپت‌های خاص نوع سلول استفاده می‌کند. ما از استرهای دوگانه برای شناسایی بصری RBها و EBها استفاده می‌کنیم. سؤال‌های هدف‌گذاری شده برای ژن‌های مورد نظر طوری طراحی می‌شوند که با آ amplifiers فلوئورسنت HCR متمایز طیفی تعامل داشته باشند. این سیستم چندگانه و منعطف، مکان‌یابی دقیق زمانی و مکانی mRNAهای خاص در اشکال سلولی شناسایی شده کلامیدیا را امکان‌پذیر می‌سازد.

متن کامل اصلی