Labeling and Detection of Peptidoglycan in Chlamydia and Chlamydia-Related Organisms Utilizing D-Alanine Analogs.

چکیده اصلی

The incorporation and visualization of modified D-amino acids into the peptidoglycan (PG) of actively replicating microbes have made a tremendous impact on the field of bacterial physiology. Here, we describe the optimization of this technique for labeling PG in obligate, intracellular Chlamydia species as well as Chlamydia-like organisms. Fluorescent D-amino acids (FDAAs) are D-alanine analogs that readily incorporate into the stem peptides of living bacteria and can be visualized rapidly with a fluorescence microscope without the need for laborious postfixation procedures. By comparison, D-amino acid analogs (DAAAs) and D-amino acid dipeptides (DAADs) similarly incorporate into newly synthesized peptidoglycan but require postfixation steps to effectively visualize PG. These probes were foundational in demonstrating the presence of PG in Protochlamydia and Chlamydia species, and PG labeling is a convenient tool that can augment other fluorescence imaging approaches. Here, we provide a protocol for the incorporation of D-alanine analogs into the PG of intracellular bacteria and the subsequent steps enabling these amino acids to be visualized via fluorescence microscopy. We also describe the use of an analysis tool that enables the mapping of PG-labeled objects in three-dimensional space and a protocol for confirming that modified amino acids are incorporating into bacterial PG.

ترجمه فارسی چکیده

ادغام و تصویربرداری از اسیدهای آمینه D-تغییریافته در پلی‌ساکارید دیواره سلولی (PG) میکروارگانیسم‌های در حال تکثیر فعال، تأثیر بزرگی در زمینه فیزیولوژی باکتری داشته است. در اینجا، بهینه‌سازی این تکنیک برای برچسب‌گذاری PG در گونه‌های کلامیدیا اجباری و داخلی و ارگانیسم‌های شبیه کلامیدیا توصیف شده است. اسیدهای آمینه D-تغییریافته فلورسنت (FDAAs) که آنالوگ‌های D-آلانین هستند، به راحتی در پپتیدهای استوانه‌ای باکتری‌های زنده ادغام می‌شوند و می‌توانند به سرعت با میکروسکوپ فلورسنت بدون نیاز به مراحل پیچیده پس از ثابت‌سازی، تصویربرداری شوند. مقایسه با آنالوگ‌های اسید آمینه D (DAAAs) و دی‌پپتیدهای اسید آمینه D (DAADs) نشان می‌دهد که هر دو نیز در PG تازه سنتز شده ادغام می‌شوند اما برای تصویربرداری مؤثر PG نیاز به مراحل پس از ثابت‌سازی دارند. این سنجش‌ها در اثبات وجود PG در گونه‌های پروتوکلامیدیا و کلامیدیا بنیادین بودند و برچسب‌گذاری PG ابزاری راحت است که می‌تواند رویکرد‌های دیگر تصویربرداری فلورسنت را تقویت کند. در اینجا، پروتکل ادغام آنالوگ‌های D-آلانین در PG باکتری‌های داخلی و مراحل بعدی برای امکان‌پذیری تصویربرداری این اسیدهای آمینه از طریق میکروسکوپ فلورسنت ارائه شده است. همچنین استفاده از یک ابزار تحلیلی برای نقشه‌برداری اشیاء برچسب‌خورده PG در فضا سه‌بعدی و پروتکلی برای تأیید اینکه اسیدهای آمینه تغییر یافته در PG باکتری ادغام می‌شوند، توصیف شده است.

متن کامل اصلی