Deep Insights Without Clearing: An Optimized Protocol for Patient-Derived Whole-Organoid Immunofluorescence Imaging.

چکیده اصلی

Here, we present an optimized whole-organoid immunofluorescence staining protocol that preserves morphology, achieves uniform antibody penetration, and enables deep-tissue imaging without the need for tissue clearing. Organoids are three-dimensional, self-organizing structures that replicate many of the cellular and architectural features of their tissue of origin, making them powerful preclinical models for studying development, disease, and therapeutic responses. Most organoid research is performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) samples, in which organoids are sectioned across the Z-planes. While this method facilitates conventional histological analysis, it limits spatially resolved visualization of protein expression and tissue organization. The inherent density and abundant extracellular matrix of organoids present substantial barriers to reagent penetration and imaging depth, further constraining the ability to capture their three-dimensional architecture in full. Our new workflow includes steps for fixation, permeabilization, and antibody incubation and has been validated on intestinal organoids using markers for different membrane-associated proteins. By providing high-quality staining through the full organoid depth without clearing, this protocol streamlines sample preparation, reduces processing artifacts, and allows more rapid, accurate 3D mapping of cell types and structures in organoid-based research.

ترجمه فارسی چکیده

در اینجا، ما یک پروتکل بهینه‌شده برای رنگ‌آمیزی کل‌ساختارهای ارگانیوید با ایمنوفلوئورسانس را ارائه می‌دهیم که با حفظ مورفولوژی، دستیابی به نفوذ یکنواخت آنتی‌بادی و امکان تصویربرداری با عمق بافت بدون نیاز به شفاف‌سازی بافت، همراه است. ارگانیویدها ساختارهای سه‌بعدی و خودسازمان‌دهنده‌ای هستند که بسیاری از ویژگی‌های سلولی و معماری بافت اصلی خود را بازتولید می‌کنند، که آن‌ها را به مدل‌های پیش‌بالینی قدرتمندی برای مطالعه توسعه، بیماری و پاسخ‌های درمانی تبدیل می‌کند. اکثر تحقیقات ارگانیوید بر روی نمونه‌های ثابت شده با فرمالین و درون‌گذاری شده در پارافین (FFPE) انجام می‌شود، که در آن ارگانیویدها در راستای صفحات Z برش می‌خورند. در حالی که این روش تحلیل هیستولوژیک متداول را تسهیل می‌کند، نمایش بصری مکانی با تفکیک بالا از بیان پروتئین و سازماندهی بافت را محدود می‌کند. چگالی و ماتریکس خارج سلولی فراوان ارگانیویدها موانع قابل توجهی برای نفوذ عوامل شیمیایی و عمق تصویربرداری ایجاد می‌کنند که قابلیت ثبت کامل معماری سه‌بعدی آن‌ها را محدود می‌کند. گردش کار جدید ما شامل مراحل ثابت‌سازی، نفوذپذیری و استراحت آنتی‌بادی است و با استفاده از نشانگرهای پروتئین‌های مختلف مرتبط با غشا در ارگانیویدهای روده، تأیید شده است. با ارائه رنگ‌آمیزی با کیفیت بالا از طریق کل عمق ارگانیوید بدون شفاف‌سازی، این پروتکل آماده‌سازی نمونه را ساده می‌کند، خطاهای فرآیند را کاهش می‌دهد و امکان نقشه‌برداری سریع‌تر و دقیق‌تر سه‌بعدی از انواع سلولی و ساختارها در تحقیقات مبتنی بر ارگانیوید را فراهم می‌کند.

متن کامل اصلی