Monitoring Calcium Dynamics in Pig Intestinal Organoids with FLIM and FRET.

چکیده اصلی

Intracellular calcium signaling plays a crucial role in intestinal epithelial function. In this chapter, we describe a method to monitor calcium dynamics in live pig small intestinal organoids using stably expressed genetically encoded FRET-based biosensor in combination with intensity-based ratiometric and fluorescence lifetime imaging (FLIM) microscopy readouts. The calcium biosensor Twitch-2B was introduced into organoids by electroporation. Despite the modest lifetime contrast, the biosensor provides a highly reliable ratiometric signal and is compatible with both conventional fluorescence and FLIM-based imaging platform. Following electroporation, organoids are allowed to form and subsequently were selected to establish stable biosensor-expressing lines. This is followed by the live microscopy of heterogeneous and cell-specific calcium responses upon pharmacological stimulation. The presented protocol offers a versatile approach for studies of calcium signaling in relevant 3D cell models, such as organoids and tissues-on-a-chip.

ترجمه فارسی چکیده

سیگنال‌دهی درون‌سلولی کلسیم نقش حیاتی در عملکرد اپیتلیوم روده ای دارد. در این فصل، روشی برای پایش پویایی‌های کلسیم در اندام‌های ریز روده‌ی کوچک خوک زنده با استفاده از حسگر زیستی مبتنی بر FRET بیان ژن‌دار پایدار در کنار خوانش‌های میکروسکوپی FLIM و مبتنی بر نسبت، توصیف شده است. حسگر کلسیم Twitch-2B از طریق الکتروپوراسیون وارد اندام‌های ریز شد. با وجود تضاد نسبتاً کم در طول عمر، حسگر سیگنال نسبت‌سنجی بسیار قابل اعتمادی ارائه می‌دهد و با هر دو پلتفرم تصویربرداری مبتنی بر فلورسانس و FLIM سازگار است. پس از الکتروپوراسیون، اندام‌های ریز اجازه داده شد تا شکل بگیرند و سپس برای ایجاد خطوط بیان حسگر پایدار انتخاب شدند. این امر با میکروسکوپی زنده پاسخ‌های کلسیمی غیرهمگن و سلول‌ویژه در پاسخ به تحریک دارویی دنبال می‌شود. پروتکل ارائه شده رویکرد منعطفی برای مطالعه سیگنال‌دهی کلسیم در مدل‌های سلولی سه بعدی مرتبط مانند اندام‌های ریز و بافت‌ها روی تراشه ارائه می‌دهد.

متن کامل اصلی