Animal-Free Intestinal Epithelial 2D "Organoid-Sheet" Cultures Using Invasin.

چکیده اصلی

The intestinal epithelium consists of a single layer of polarized cells that serves as a crucial barrier against pathogens while mediating food digestion and nutrient absorption. The differentiated villus cells, important for the intestine's function, originate from rapidly dividing Lgr5+ stem cells located in the intestinal crypts. These stem cells can be expanded in vitro and form three-dimensional (3D) "mini-organs" known as intestinal organoids, which closely phenocopy the intestinal epithelium. The development and maintenance of these 3D organoids depend on a defined growth factor cocktail and on extracellular matrix (ECM) support to preserve apical-basal polarity - an essential feature for nutrient uptake, growth, and the barrier function. Matrigel or BME has been used as the standard ECM hydrogel scaffold for organoid culture. Recently, we identified the bacterial protein Invasin as a defined ECM substitute that can fully recapitulate Matrigel/BME function. Utilizing recombinant Invasin coated on transwells, we developed a two-dimensional (2D) intestinal monolayer culture system. The intestinal stem cells form a polarized, confluent epithelial sheet while maintaining stemness and differentiation capacity into functional epithelial cell types. Compared to traditional 3D cultures, this 2D system offers advantages such as improved imaging, easier access to apical and basal compartments, and compatibility with automation for high-throughput applications. Here, we present a detailed protocol for generating 2D intestinal monolayers using Invasin, starting from either fresh human intestinal tissue or from pre-established 3D organoids. These 2D Invasin-cultures recapitulate key aspects of intestinal epithelial biology and are amenable to a broad range of experimental manipulations, including studies on gene function, disease modeling, pathogen interaction, co-cultures, and cell fate determination. These defined 2D-Invasin "organoid-sheets" cultures support the realization of clinical applications using healthy and patient-derived intestinal epithelial cells.

ترجمه فارسی چکیده

اپیتلیوم روده از یک لایه سلول‌های قطبی تشکیل شده است که به عنوان یک مانع حیاتی در برابر عوامل بیماری‌زا عمل می‌کند. سلول‌های تیغه‌ای که برای عملکرد روده حیاتی هستند، از سلول‌های بنیادی Lgr5+ در لایه‌های عمیق روده می‌آیند. این سلول‌های بنیادی می‌توانند در محیط آزمایشگاهی تکثیر شوند و به ساختارهای سه بعدی (3D) به نام «ارگانوئید» تبدیل شوند که شباهت زیادی به اپیتلیوم روده دارند. توسعه و حفظ این ارگانوئیدها به یک ترکیب مشخص از عوامل رشد و پشتیبانی ماتریس خارج سلولی (ECM) بستگی دارد. ماتریژل یا BME به عنوان استاندارد استفاده می‌شوند. اخیراً، پروتئین باکتریایی اینوازین به عنوان جایگزین تعریف شده‌ای شناسایی شد که می‌تواند عملکرد ماتریژل/BME را به طور کامل بازتولید کند. با استفاده از اینوازین بازسازی شده روی ترانزول‌ها، یک سیستم فرهنگ سلولی تک‌لایه‌ای دو بعدی (2D) توسعه یافت. سلول‌های بنیادی روده لایه اپیتلیال همبند و قطبی را تشکیل می‌دهند در حالی که توانایی خود را در حفظ ویژگی‌های بنیادی و تفاوت‌یابی به سلول‌های تخصصی حفظ می‌کنند. این سیستم 2D نسبت به فرهنگ‌های 3D سنتی مزایایی مانند تصویربرداری بهتر، دسترسی آسان به محفظه‌های فوقانی و تحتانی و سازگاری با اتوماسیون برای کاربردهای با ظرفیت بالا دارد. اینجا، یک پروتکل دقیق برای تولید لایه‌های تک‌لایه‌ای روده با استفاده از اینوازین، شروع از بافت روده انسانی تازه یا از ارگانوئیدهای 3D موجود ارائه شده است. این فرهنگ‌های 2D اینوازین جنبه‌های کلیدی زیست‌شناسی اپیتلیوم روده را بازتولید می‌کنند و برای طیف وسیعی از تغییرات آزمایشی، از جمله مطالعات عملکرد ژن، مدل‌سازی بیماری، تعامل باکتری‌ها، هم‌کشت‌ها و تعیین سرنوشت سلولی مناسب هستند.

متن کامل اصلی