PAGE-Based Measurements of nsP2 Protease Activity.

چکیده اصلی

In this protocol, we describe a PAGE-based assay to evaluate the steady-state kinetics of the nsP2 protease. Using a recombinant GFP-TRX fusion substrate containing the nsP3/4 cleavage site, proteolytic activity is monitored through the appearance of cleavage products resolved by SDS-PAGE. Detection is achieved by Coomassie blue staining or GFP fluorescence emission, followed by densitometric analysis to quantify product formation and calculate initial reaction rates. The protocol provides a robust and accessible method for comparing enzyme activity under varying conditions, and is suitable for studies of substrate specificity, inhibitor screening, and the mechanistic characterization of protease function.

ترجمه فارسی چکیده

در این پروتکل، ما یک تست مبتنی بر PAGE را برای ارزیابی دینامیک‌های ثابت‌حال پروتئاز nsP2 توصیف می‌کنیم. با استفاده از یک زیرساخت ادغام شده GFP-TRX بازسازی‌شده که حاوی محل برش nsP3/4 است، فعالیت پروتئولیتیک از طریق ظهور محصولات برش که با SDS-PAGE تفکیک می‌شوند، پایش می‌شود. تشخیص از طریق رنگ‌آمیزی آبی کوماسی یا ساطع‌شدن فلورسنس GFP انجام می‌شود و با تحلیل رزولوشن‌سنجی برای کمی‌سازی تشکیل محصول و محاسبه نرخ‌های واکنش اولیه دنبال می‌شود. این پروتکل روشی مقاوم و دسترسی‌پذیر برای مقایسه فعالیت آنزیم در شرایط متغیر فراهم می‌کند و برای مطالعات تخصصی‌سازی زیرساخت، غربالگری مهارکننده‌ها و توصیف مکانیسم عمل پروتئاز مناسب است.

متن کامل اصلی