Quantitative and amino acid sequence analysis of soluble HIV-1 Vpu and calmodulin interactions.

چکیده اصلی

HIV-1 Vpu supports viral adaptation through host-protein interactions. Although mainly membrane-associated, we recently identified a soluble Vpu form that forms a stable complex with Ca2+-bound calmodulin (Ca2+-CaM), potentially influencing Vpu trafficking. Here, to determine the binding affinity and identify regions of soluble Vpu involved in CaM binding, we used ensemble Förster resonance energy transfer (eFRET). We tested Cy3-labeled full-length (FL) Vpu, a C-terminal fragment (helices 2 and 3), and a Cy3-labeled FL Vpu V22A/W23Y/I33N mutant with substitutions of key residues in Vpu's helix 1 and helices 1-to-2 loop having a role in the interaction with Ca2+-CaM. All Vpu variants were labeled at residue L42C. Ca2+-CaM was tagged with Cy5 at residue S39C. eFRET analysis of 100 nM Cy3-Vpu variants mixed with Cy5-Ca2+-CaM (in the range 100 nM-2.5 μM) revealed heterocomplexes formation with characteristic dissociation constants (Kd) and binding free energies (∆G). FL Vpu-Ca2+-CaM showed highest stability (Kd ~74 nM, ∆G ~-9.7 kcal/mol), while the truncated C-terminal region and V22A/W23Y/I33N mutant formed weaker complexes with Ca2+-CaM (Kd~182 nM and 800 nM, ∆G ~-9.2 kcal/mol and ~-8.3 kcal/mol). The reduced Vpu-Ca2+-CaM stability after disruption of binding sites in and near Vpu helix 1 may explain how this interaction is regulated, including through lipid competition that promotes Vpu membrane insertion. We propose that, at the membrane, hydrophobic helix 1 dissociates from Ca2+-CaM and inserts into the lipid bilayer, weakening the complex and releasing CaM. These findings clarify HIV-1 Vpu interactions with cellular components and may inform antiviral development.

ترجمه فارسی چکیده

HIV-1 Vpu از طریق تعامل با پروتئین‌های میزبان، سازگاری ویروسی را پشتیبانی می‌کند. اگرچه عمدتاً به غشا متصل است، ما اخیراً یک فرم محلول Vpu را شناسایی کردیم که با کال‌مودولین یونیزه شده با کلسیم (Ca2+-CaM) پیوند پایداری تشکیل می‌دهد که ممکن است بر مسیر یابی Vpu تأثیر بگذارد. برای تعیین قدرت پیوند و شناسایی مناطق فرعی Vpu درگیر در پیوند با CaM، از روش eFRET استفاده شد. تحلیل eFRET نشان داد که FL Vpu بیشترین پایداری را با Ca2+-CaM نشان داد (Kd ~74 nM)، در حالی که قطعه C-ترمینال و مولتی‌نوکلئوتید V22A/W23Y/I33N پیوندهای ضعیف‌تری تشکیل دادند. ما پیشنهاد می‌کنیم که در غشا، هلیکس ۱ آبدوست از Ca2+-CaM جدا شده و در لایه لیپیدی فرو می‌رود که منجر به تضعیف پیوند و آزادسازی CaM می‌شود.

متن کامل اصلی