Structural and mechanistic insights into catalytic promiscuity of PLP-dependent enzymes of fold type IV: A case study of aminodeoxychorismate lyase from Micromonospora aurantiaca.

چکیده اصلی

Pyridoxal-5'-phosphate (PLP)-dependent enzymes of fold type IV exhibit remarkable catalytic diversity, catalyzing either S- and R-selective transamination or β-elimination within a highly conserved structural scaffold. Here, we report the identification, biochemical characterization, and structural analysis of PLP fold type IV 4-amino-4-deoxychorismate lyase (ADCL) from Micromonospora aurantiaca (Micau5708). Sequence-structural analysis revealed a hybrid architecture of the active site of Micau5708. It combines a D-amino acid transaminase (DATA) conserved phenylalanine (F30) and arginine (R87) residues with an ADCL-specific threonine residue (T32) and a (R)-selective amine transaminase-specific histidine residue (H25). While Micau5708 shows only ADCL activity, substitution H25R introduces transamination activity, preserving ADCL activity. The 1.85 Å resolution crystal structure of Micau5708 in complex with substrate analog chorismate provides the first direct visualization of substrate binding in an ADCL active site. Site-directed mutagenesis, together with comparative analysis of DATAs of group II demonstrates that ADCL/DATA catalytic promiscuity is enabled by a specific amino acid combination in the active site: phenylalanine, threonine, and arginine residues (F30, T32, and R87), and arginine at position 25 with a flexible side chain. Furthermore, the Micau5708-chorismite complex structure has helped revise the catalytic mechanism of ADCLs, demonstrating the T32 assistance in protonation of the oxygen atom rather than the β-methylene carbon of the leaving enol-pyruvate. Together, these findings provide new insights into the structural basis of reaction specificity, catalytic promiscuity, and evolutionary plasticity within the PLP fold type IV enzyme superfamily. They also highlight the limitations of sequence-based functional prediction.

ترجمه فارسی چکیده

آنزیم‌های وابسته به پیریدوکستال-۵'-فسفات (PLP) از نوع فولد IV، تنوع کاتالیتیک قابل توجهی را نشان می‌دهند و در یک اسکلت ساختاری بسیار حفظ‌شده، هم انتقال آمین S- و R-انتخابی و هم حذف β را کاتالیز می‌کنند. در اینجا، ما شناسایی، توصیف بیوشیمیایی و تحلیل ساختاری آنزیم ۴-آمینو-۴-دکسی‌کرومات لیز (ADCL) از PLP فولد IV از مایکومونوسپورا آورانتیاکا (Micau5708) را گزارش می‌کنیم. تحلیل توالی-ساختاری نشان داد که سایت فعال Micau5708 دارای معماری هیبریدی است. این سایت ترکیبی از باقی‌مانده‌های فنیل‌آلانین (F30) و آرژنین (R87) از ترانس‌آمیناز اسیدهای آمینه D (DATA) با باقی‌مانده تریونین (T32) مخصوص ADCL و باقی‌مانده هیستیدین (H25) مخصوص ترانس‌آمینازهای آمین (R-انتخابی) است. در حالی که Micau5708 فقط فعالیت ADCL را نشان می‌دهد، جایگزینی H25R فعالیت ترانس‌آمیناسیون را معرفی می‌کند و فعالیت ADCL را حفظ می‌کند. ساختار بلوری با رزولوشن ۱.۸۵ Å از Micau5708 در پیچیدگی آنالوگ زیرساختاری کرومات، اولین تصویر مستقیم از اتصال زیرساختاری در یک سایت فعال ADCL را ارائه می‌دهد. مهندسی ژنتیکی مبتنی بر سایت و تحلیل مقایسه‌ای DATAs از گروه II نشان می‌دهد که پلیمراسیون کاتالیتیک ADCL/DATA توسط ترکیب خاصی از باقی‌مانده‌های آمینواسیدی در سایت فعال: فنیل‌آلانین، تریونین و آرژنین (F30، T32 و R87) و آرژنین در موقعیت ۲۵ با زنجیره جانبی انعطاف‌پذیر، امکان‌پذیر است. علاوه بر این، ساختار پیچیدگی Micau5708-chorismite به بازبینی مکانیسم کاتالیتیک ADCLs کمک کرده است که نشان می‌دهد T32 در پروتون‌دهی اتم اکسیژن به جای کربن متا-متیلن خروجی انول-پیرووات نقش دارد. این یافته‌ها، دیدگاه‌های جدیدی در مورد پایه ساختاری خاصیت واکنش، پلیمراسیون کاتالیتیک و پلاستیسیته تکاملی در خانواده فرا-آنزیمی PLP فولد IV ارائه می‌دهند.

متن کامل اصلی