Epitope Tagging and Coimmunoprecipitation to Identify Viral Protein Interactors.

چکیده اصلی

Affinity purification-mass spectrometry (AP-MS) is a powerful proteomic approach for dissecting the interaction network between virus and host. Traditional AP-MS employs overexpression of viral proteins as baits to enrich host interactors. However, overexpressed viral proteins may mislocalize to inappropriate cellular compartments and trigger endoplasmic reticulum stress by overwhelming the protein-folding machinery, which leads to false identification of host factors. To overcome these limitations, we introduce an AP-MS strategy based on direct infection with an epitope-tagged chikungunya virus (CHIKV/myc-E2), which we used to successfully uncover two new antiviral factors in CHIKV cellular reservoirs-macrophages. In this protocol, we will describe this technique step by step: (1) design and construction of myc-tagged virus by advanced multi-fragment assembly, (2) in vitro transcription and preparation of infectious myc-tagged virus stocks, and (3) immunoprecipitation of myc-tagged viral protein and its interactome for mass spectrometry analysis. This strategy enables accurate identification of viral interactors in a physiologically relevant context, providing a framework for future proteomic studies using tagged viruses.

ترجمه فارسی چکیده

تجزیه و تحلیل شبکه‌های تعامل بین ویروس و میزبان با استفاده از روش‌های پروتئومیک (AP-MS) قدرتمندی است. روش‌های سنتی AP-MS معمولاً با بیش‌برازش پروتئین‌های ویروسی به عنوان طعمه، هم‌کنش‌گرهای میزبان را غنی می‌کنند. اما این پروتئین‌های بیش‌برازش شده ممکن است به بخش‌های سلولی نامناسبی مهاجرت کنند و استرس رتیکولوم انتروپلاسمی را تحریک کنند که منجر به شناسایی غلط عوامل میزبان می‌شود. برای غلبه بر این محدودیت‌ها، ما یک استراتژی AP-MS مبتنی بر عفونت مستقیم با ویروس چیکونگونیا برچسب‌خورده (CHIKV/myc-E2) را معرفی می‌کنیم که با آن دو عامل ضدویروس جدید در ذخایر سلولی CHIKV - ماکروفاژها - شناسایی شد. در این پروتکل، این تکنیک مرحله به مرحله توصیف می‌شود: (۱) طراحی و ساخت ویروس برچسب‌خورده myc با استفاده از مونومرهای چندتکه، (۲) ترنسکریپت درون‌کیسه‌ای و آماده‌سازی استوک‌های ویروسی عفونی برچسب‌خورده myc، و (۳) کوایمونوپرایپیتیشن پروتئین ویروسی برچسب‌خورده myc و هم‌کنش‌گران آن برای تحلیل اسپکتروم‌سنجی جرمی. این استراتژی شناسایی دقیق هم‌کنش‌گرهای ویروسی را در یک زمینه فیزیولوژیک مرتبط ممکن می‌سازد.

متن کامل اصلی