Implementation of Nonisobaric TMT Analogs for Accurate Precursor-Level Quantification by plexDIA.

چکیده اصلی

RATIONALE: Multiplexed quantitative proteomics enables simultaneous analysis of multiple biological samples, increasing throughput while reducing instrument time and sample requirements. However, integrating sample multiplexing with data-independent acquisition (DIA) remains challenging. We present a TMTpro plexDIA strategy leveraging MS1-level mass differences between nonisobaric TMTpro reagent variants to enable multiplexed quantification without compromising DIA sensitivity. METHODS: Three Saccharomyces cerevisiae deletion strains (Δmet6, Δpfk2, and Δura2) were labeled with TMTproZero (light), TMTpro16 (standard), and super-heavy TMTpro (heavy), mixed in three permutations, and analyzed by narrow-window DIA (2 m/z isolation, 300 scan events) on an Orbitrap Astral mass spectrometer. Database searching was performed using FragPipe/MSFragger with plex-DIA quantification enabled. RESULTS: Over 2000 protein groups and over 20 000 precursors were identified per channel per mixture, with closely matched identification rates across all three channels. All nine expected deletion patterns were correctly identified, with channel-specific depletion reproduced consistently across precursor charge states (2+, 3+, and 4+). CONCLUSIONS: TMTpro plex-DIA enables accurate, multiplexed quantitative proteomics through MS1-level mass separation of the nonisobaric TMTpro isotopologs. The characteristic deletion patterns observed for each knockout strain serve as intrinsic molecular barcodes, validating sample identity and demonstrating the broad utility of plex-DIA for high-throughput, multiplexed proteomics applications.

ترجمه فارسی چکیده

مبنای توجیه: پروتئومتریک کمی چندگانه امکان تحلیل همزمان نمونه‌های زیستی متعدد را فراهم می‌کند که همزمانی را افزایش می‌دهد و زمان دستگاه و نیاز به نمونه را کاهش می‌دهد. با این حال، ادغام چندگانه‌سازی نمونه با تجزیه و تحلیل مستقل از داده (DIA) همچنان چالش‌برانگیز است. ما استراتژی TMTpro plexDIA را ارائه می‌دهیم که از تفاوت‌های جرمی سطح MS1 بین آنالوگ‌های غیرهم‌باری TMTpro برای امکان‌سنجی اندازه‌گیری چندگانه بدون کاهش حساسیت DIA استفاده می‌کند. روش‌ها: سه خطای حذف مخمر (Δmet6، Δpfk2 و Δura2) با TMTproZero (سبک)، TMTpro16 (استاندارد) و TMTpro سنگین (سنگین) برچسب‌گذاری شدند، در سه ترتیب مخلوط شدند و با استفاده از DIA پنجره‌بندی باریک (۲ واحد m/z جداسازی، ۳۰۰ رویداد اسکن) روی اسپکترومتر جرمی Orbitrap Astral تحلیل شدند. جستجوی پایگاه داده با استفاده از FragPipe/MSFragger با فعال‌سازی اندازه‌گیری plex-DIA انجام شد. نتایج: بیش از ۲۰۰۰ گروه پروتئین و بیش از ۲۰,۰۰۰ پیش‌ساز در هر کانال هر مخلوط شناسایی شدند، با نرخ‌های تشخیص هم‌خوان در تمام سه کانال. تمام ۹ الگوی حذف مورد انتظار به درستی شناسایی شدند و حذف خاص کانال در تمام حالات بار (۲+، ۳+ و ۴+) به طور ثابت تکرار شد. نتیجه‌گیری‌ها: TMTpro plex-DIA با استفاده از جداسازی جرمی سطح MS1 آنالوگ‌های غیرهم‌باری TMTpro، پروتئومتریک کمی چندگانه دقیق را ممکن می‌سازد. الگوهای حذف مشخص مشاهده‌شده برای هر خطای حذف به عنوان بارکدهای مولکولی درونی عمل می‌کنند که هویت نمونه را تایید می‌کنند و کاربرد گسترده plex-DIA برای کاربردهای پروتئومتریک با ظرفیت بالا و چندگانه را نشان می‌دهند.

متن کامل اصلی