A cost-effective and rapid TE-based DNA extraction for near point-of-care detection of Babesia spp. by RPA/CRISPR-Cas12a.

چکیده اصلی

BACKGROUND: Babesia spp. infects a wide range of mammals, including domestic animals, wildlife, and humans, highlighting the need for rapid diagnostics. This study developed a near point-of-care method combining rapid DNA extraction, recombinase polymerase amplification (RPA), and CRISPR-Cas12a for Babesia detection. METHODS AND RESULTS: The workflow includes three steps: DNA extraction, RPA amplification, and CRISPR-Cas12a signal detection. Five blood DNA extraction methods were evaluated: DNeasy kit, boiling, Tris-EDTA (TE) buffer, methanol-based, and Chelex®100. The commercial kit, boiling method, and TE buffer extraction yielded positive results using RPA/CRISPR-Cas12a based on the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene. The TE buffer extraction and boiling methods were further optimized by RPA/CRISPR-Cas12a assay using Babesia-specific primers based on the 18S rRNA gene. All these extraction methods produced results comparable to the commercial kit. The TE buffer extraction was selected due to its simplicity and speed. The RPA/CRISPR-Cas12a assay specifically detected Babesia spp., including B. vogeli, B. gibsoni, and B. ovata. The limit of detection using TE-extracted DNA was 104 copies per reaction, lower than that achieved with the commercial kit (103 copies per reaction). Evaluation of rapid DNA extraction for Babesia spp. detection by the RPA/CRISPR-Cas12a assay using seven bovine and eight canine blood samples showed complete concordance between the TE buffer extraction and the commercial kit, with six positive samples detected. CONCLUSIONS: The TE buffer extraction offered a low-cost, simple, and equipment-minimal approach suitable for combination with RPA/CRISPR-Cas12a diagnostics, enabling rapid detection of Babesia spp. in resource-limited or field settings.

ترجمه فارسی چکیده

Babesia spp. طیف وسیعی از پستانداران از جمله حیوانات خانگی، حیات وحش و انسان‌ها را آلوده می‌کند که نیاز به تشخیص سریع را برجسته می‌کند. این مطالعه یک روش نزدیک به نقطه مراقبت را توسعه داد که شامل استخراج سریع DNA، آمپلیفیکاسیون پلیمراز بازترکیب‌شونده (RPA) و تشخیص سیگنال CRISPR-Cas12a برای تشخیص Babesia است. پنج روش استخراج DNA خون ارزیابی شدند: kit DNeasy، جوشاندن، حلال TE، مبتنی بر متانول و Chelex®100. استخراج با kit تجاری، روش جوشاندن و حلال TE نتایج مثبت را با استفاده از RPA/CRISPR-Cas12a بر اساس ژن COI ایجاد کردند. روش‌های استخراج TE و جوشاندن با استفاده از RPA/CRISPR-Cas12a و با استفاده از پلی‌مریمرهای اختصاصی Babesia مبتنی بر ژن 18S rRNA بهینه‌سازی شدند. تمام این روش‌های استخراج نتایجی قابل مقایسه با kit تجاری تولید کردند. استخراج با حلال TE به دلیل سادگی و سرعت انتخاب شد. تست RPA/CRISPR-Cas12a به طور خاص Babesia spp. از جمله B. vogeli، B. gibsoni و B. ovata را تشخیص داد. حد تشخیص با DNA استخراج شده با TE 104 کپی در هر واکنش بود که کمتر از آنچه با kit تجاری به دست آمد (103 کپی در هر واکنش) بود. ارزیابی استخراج سریع DNA برای تشخیص Babesia spp. با استفاده از RPA/CRISPR-Cas12a با استفاده از هفت نمونه خون گاوی و هشت نمونه خون سگ نشان داد همخوانی کامل بین استخراج حلال TE و kit تجاری، با شناسایی شش نمونه مثبت. حلال TE استخراج یک رویکرد ارزان، ساده و با حداقل تجهیزات را که برای ترکیب با تشخیص RPA/CRISPR-Cas12a مناسب است، فراهم کرد و امکان تشخیص سریع Babesia spp. در محیط‌های با منابع محدود یا میدانی را فراهم کرد.

متن کامل اصلی