Split-GFP Reporter-Based Detection of Chlamydia trachomatis Inclusion Damage.

چکیده اصلی

Chlamydia trachomatis, an obligate intracellular pathogen responsible for trachoma and widespread urogenital infections, replicates exclusively within the confines of a membrane-bound vacuole known as the inclusion. This compartment shields the bacterium from host cellular immune detection; thus, clarifying how inclusion integrity is maintained and protected from vacuole-destabilizing host attacks may identify new therapeutic strategies. To enable such insights, we recently developed split-GFP-based microscopic reporters that can detect early forms of membrane damage and track individual bacteria released from compromised inclusions. These reporters rely on infecting GFP1-10-expressing cells with C. trachomatis strains engineered to express either a GFP11-tagged outer membrane protein, exposing GFP11 on the bacterial surface, or a GFP11-tagged inclusion membrane protein, exposing GFP11 to the inclusion lumen. Damage to the inclusion allows GFP1-10 to access the bacteria and inner surface of the inclusion membrane, leading to GFP reconstitution and fluorescence at either cytosol-exposed bacteria or damaged membrane sites. Here, we provide detailed protocols for applying these reporter systems, including the generation of the required bacterial strains, development of a GFP1-10-expressing cell line, and execution of a representative infection experiment.

ترجمه فارسی چکیده

چلامیدیا تراکوماتیس، یک عامل بیماری‌زا داخلی اجباری که مسئول عینک‌کشی و عفونت‌های گسترده ادراری-تناسلی است، به طور انحصاری در قفسه‌ای حاوی غشا شناخته شده به عنوان درون‌گوشته تکثیر می‌شود. این کانال‌بافه باکتری را از شناسایی ایمنی سلولی میزبان محافظت می‌کند؛ بنابراین، روشن شدن اینکه چگونه یکپارچگی درون‌گوشته حفظ و از حملات مخرب میزبان در برابر ناپایداری واکوول حفاظت می‌شود، می‌تواند استراتژی‌های درمانی جدید را شناسایی کند. برای دستیابی به چنین بینش‌هایی، اخیراً گزارش‌گرهای میکروسکوپی مبتنی بر تقسیم‌شده-GFP را توسعه دادیم که می‌توانند اشکال اولیه آسیب به غشا را تشخیص دهند و باکتری‌های منفرد آزاد شده از درون‌گوشته‌های آسیب‌دیده را ردیابی کنند. این گزارش‌گرها وابسته به آلوده کردن سلول‌های بیان‌کننده GFP1-10 با استراین‌های مهندسی شده C. trachomatis هستند که یا پروتئین غشای بیرونی برچسب‌دار شده با GFP11 را بیان می‌کنند که GFP11 را در سطح باکتری آشکار می‌سازند، یا پروتئین غشای درون‌گوشته برچسب‌دار شده با GFP11 را بیان می‌کنند که GFP11 را به لumen درون‌گوشته آشکار می‌سازند. آسیب به درون‌گوشه باعث دسترسی GFP1-10 به باکتری‌ها و سطح داخلی غشای درون‌گوشته می‌شود که منجر به بازسازی GFP و فلورسانس در باکتری‌های آشکار به سیتوپلاسم یا سایت‌های غشای آسیب‌دیده می‌شود. در اینجا، پروتکل‌های دقیقی برای اعمال این سیستم‌های گزارش‌گر، شامل تولید استراین‌های باکتریایی مورد نیاز، توسعه خط سلولی بیان‌کننده GFP1-10 و اجرای یک آزمایش عفونت نمونه ارائه می‌دهیم.

متن کامل اصلی