Live Cell Imaging of Chlamydia Inclusion Membrane Proteins Using Genetically Encoded Antibodies.

چکیده اصلی

Chlamydia subverts host cell pathways by secreting effector proteins into the membrane of its inclusion. These bacterial membrane proteins, called Incs, mediate interactions between the inclusion and the host cell. To study Inc protein dynamics in live cells, we have developed a methodology that relies on host cell expression of antibodies fused to fluorescent proteins, known as frankenbodies, which detect epitopes exposed to the cytosol. HeLa cells are first stably transfected with a plasmid encoding an mScarlet3-tagged anti-FLAG frankenbody. These cells are then infected with Chlamydia expressing a FLAG-tagged Inc protein, which is secreted into the inclusion membrane with the FLAG tag facing the cytosol. Recruitment of the fluorescent anti-FLAG frankenbody to the inclusion is monitored in real time using time-lapse confocal microscopy. This approach has been successfully employed to elucidate the dynamics of IncA on the inclusion membrane and can be expanded to simultaneously investigate multiple Incs, as well as Inc:Inc interactions, by using different tag-frankenbody combinations.

ترجمه فارسی چکیده

چلامیدیا مسیرهای سلول میزبان را با ترشح پروتئین‌های اثرگذار به غشای حاوی خود تغییر مسیر می‌دهد. این پروتئین‌های غشایی، که Incs نامیده می‌شوند، تعامل بین حاوی و سلول میزبان را تسهیل می‌کنند. برای مطالعه دینامیک پروتئین‌های Inc در سلول‌های زنده، روشی توسعه داده شده است که بر بیان آنتی‌بادی‌های متصل به پروتئین‌های فلورسنت در سلول میزبان، که frankenbodies نامیده می‌شوند، تکیه دارد تا اپیتوپ‌های در معرض سیتوپلاسم را تشخیص دهند. سلول‌های HeLa ابتدا به طور پایدار با پلاسمید کدگذاری شده یک frankenbody آنتی‌بادی ضد FLAG با برچسب mScarlet3 ترنسفکت می‌شوند. این سلول‌ها سپس با چلامیدیا آلوده می‌شوند که یک پروتئین Inc با برچسب FLAG بیان می‌کند، که به غشای حاوی ترشح شده و با برچسب FLAG رو به سیتوپلاسم است. جذب frankenbody فلورسنت ضد FLAG به حاوی به صورت لحظه‌ای با میکروسکوپی کانفوکال زمان‌سری پایش می‌شود. این رویکرد با موفقیت برای elucidate دینامیک IncA بر روی غشای حاوی استفاده شده است و می‌تواند برای بررسی همزمان چندین Inc و تعاملات Inc:Inc با استفاده از ترکیبات مختلف برچسب-frankenbody گسترش یابد.

متن کامل اصلی