Live Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of the Epithelial Polarity and Cell-Specific Segmentation in the Small Intestinal Organoids.

چکیده اصلی

Apical-basal polarity is essential for gastrointestinal epithelium function, where the apical membrane mediates nutrient absorption, host-microbiota interactions, and pathogen defense. However, conventional intestinal organoid culture displays an "apical-in" topology, limiting functional research with respect to the apical membrane. F-actin labeling with fluorescent phalloidin, a well-established apical marker, is also incompatible with live imaging. To address these limitations, in this chapter we describe an extracellular matrix (ECM) removal protocol to achieve "apical-out" topology in porcine intestinal organoid model and further validated WGA and Nile Red live imaging tracers enabling discrimination between apical-out (AO) and basal-out (BO) organoids. Subsequently, using integrated computational pipelines (automatic nuclei segmentation and single-nucleus phasor-based lifetime analysis), we can quantify organoid proliferative states at single-nucleus resolution following BrdU and Hoechst 33342 staining. Using the analysis of Hoechst 33342 fluorescence lifetime, we demonstrate that both organoid topologies exhibit intrinsic proliferative heterogeneity, but overall proliferative capacity is topology-dependent: apical-out organoids displayed decreased proliferation, whereas basal-out organoids remain highly proliferative.

ترجمه فارسی چکیده

قطبیت آپیکال-بازال برای عملکرد اپیتلیوم گوارشی ضروری است، جایی که غشای آپیکال متابولیسم مواد مغذی، تعامل میکروبیوم میزبان و دفاع در برابر عوامل بیماری‌زا را تسهیل می‌کند. با این حال، کشت اوزوئیدهای روده‌ای سنتی دارای توپولوژی «آپیکال-در» هستند که تحقیق عملیاتی در مورد غشای آپیکال را محدود می‌کند. برچسب‌گذاری F-اکتین با فلاورسنت فاللوئیدین، یک نشانگر آپیکال شناخته‌شده، با تصویربرداری زنده سازگار نیست. برای حل این محدودیت‌ها، در این فصل، ما یک پروتکل حذف ماتریس خارج سلولی (ECM) برای دستیابی به توپولوژی «آپیکال-خارج» در مدل اوزوئید روده خوک توصیف می‌کنیم و سپس WGA و Nile Red را به عنوان ردیاب‌های تصویربرداری زنده برای تمایز بین اوزوئیدهای آپیکال-خارج (AO) و بازال-خارج (BO) تایید می‌کنیم. در مرحله بعد، با استفاده از خطوط لوله محاسباتی یکپارچه (بخش‌بندی خودکار هسته‌ها و تحلیل طول عمر مبتنی بر فازور تک‌هسته‌ای)، می‌توان وضعیت‌های تکثیری اوزوئیدها را در رزولوشن تک‌هسته‌ای پس از رنگ‌آمیزی BrdU و Hoechst 33342 اندازه‌گیری کرد. با تحلیل طول عمر فلوئورسنس Hoechst 33342، ما نشان می‌دهیم که هر دو توپولوژی اوزوئید، ناهمگونی تکثیری درونی دارند، اما ظرفیت کلی تکثیر وابسته به توپولوژی است: اوزوئیدهای آپیکال-خارج نشان‌دهنده کاهش تکثیر بودند، در حالی که اوزوئیدهای بازال-خارج همچنان بسیار تکثیرپذیر باقی ماندند.

متن کامل اصلی