A rapid and cost-effective Chelex-100 resin-based method for genomic DNA extraction from adult zebrafish tissues.

چکیده اصلی

The zebrafish (Danio rerio) is a widely used vertebrate model in biomedical research, yet the rapid and cost-effective extraction of genomic DNA (gDNA) from adult zebrafish tissue remains a practical challenge for routine molecular applications. To address this, we systematically optimized and evaluated a Chelex-100/proteinase K-based extraction protocol across eight adult zebrafish tissues (muscle, liver, heart, spleen, kidney, intestine, brain, and eggs) and compared its performance against that of a commercial kit. The optimized protocol, involving incubation at 56 °C for 15 min and boiling at 100 °C for 10 min, required approximately 25 min per sample. Across all tested tissues (3 biological replicates per tissue), the Chelex-100 method yielded gDNA concentrations ranging from 177.2 ± 3.5 ng/µL to 674.5 ± 22.1 ng/µL per 5 mg of tissue, which were generally higher than those obtained with the commercial kit. However, the purity (A260/A280 ratios) was consistently lower for the Chelex-100 method (1.36-1.83) than for the kit (1.84-2.02), indicating the coextraction of proteinaceous impurities. Despite this, Chelex-extracted gDNA supported successful PCR amplification and Sanger sequencing of target fragments, with consistent amplicon quality. In real-time PCR assays, both methods produced amplification curves, but the Chelex-100 method yielded systematically higher Ct values, suggesting reduced sensitivity with less-pure templates. Crucially, the Chelex-100 method avoided hazardous organic solvents and required no column purification, with an estimated reagent cost of <$0.20 per sample versus approximately $2.00 per sample for the commercial kit. We conclude that this optimized Chelex-100/proteinase K protocol provides a rapid, economical, and operationally simple alternative for routine gDNA extraction from adult zebrafish tissues and is particularly suitable for PCR-based genotyping, sequencing and qPCR applications, though its lower purity warrants careful consideration for high-sensitivity quantitative assays.

ترجمه فارسی چکیده

ماهی زبرف (Danio rerio) یک مدل مهره‌ای پرکاربرد در تحقیقات زیست‌پزشکی است، اما استخراج سریع و ارزان DNA ژنوم (gDNA) از بافت‌های بالغ آن چالش عملیاتی برای کاربردهای مولکولی روزمره باقی مانده است. برای حل این مشکل، ما یک پروتکل استخراج مبتنی بر Chelex-100 و پروتئیناز K را در هشت بافت بالغ ماهی زبرف (عضله، کبد، قلب، طحال، کلیه، روده، مغز و تخم‌ها) به طور سیستماتیک بهینه‌سازی و ارزیابی کردیم و عملکرد آن را با یک kit تجاری مقایسه کردیم. این پروتکل بهینه‌شده، شامل انکوباسیون در 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه و جوشیدن در 100 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه، تقریباً 25 دقیقه در هر نمونه نیاز داشت. در تمام بافت‌های تست شده (سه بازآفرینی زیستی در هر بافت)، روش Chelex-100 غلظت‌های gDNA را در محدوده 177.2 ± 3.5 تا 674.5 ± 22.1 نانوگرم/میلی‌لیتر در هر 5 میلی‌گرم بافت تولید کرد که معمولاً بالاتر از kit تجاری بود. با این حال، خلوص (نسبت A260/A280) برای روش Chelex-100 (1.36-1.83) همواره کمتر از kit (1.84-2.02) بود که نشان‌دهنده هم‌استخراج آلودگی‌های پروتئینی است. با وجود این، DNA استخراج‌شده توسط Chelex-100 پشتیبانی از آمپلیفیکاسیون PCR موفق و توالی‌یابی Sanger قطعات هدف با کیفیت آمپلیکون ثابت را فراهم کرد. در آزمون‌های qPCR، هر دو روش منحنی‌های آمپلیفیکاسیون تولید کردند، اما روش Chelex-100 مقادیر Ct بالاتر سیستماتیک را نشان داد که نشان‌دهنده حساسیت کاهش‌یافته با قالب‌های کمتر خالص است. به طور حیاتی، روش Chelex-100 از حلال‌های آلی خطرناک اجتناب کرد و نیاز به پالایش کانالی نداشت، با هزینه مواد مصرفی تخمینی کمتر از 0.20 دلار در هر نمونه در مقابل حدود 2.00 دلار برای kit تجاری. ما نتیجه می‌گیریم که این پروتکل بهینه‌شده Chelex-100/پروتئیناز K یک جایگزین سریع، اقتصادی و ساده برای استخراج gDNA روزمره از بافت‌های ماهی زبرف بالغ است و برای کاربردهای ژنوتیپینگ مبتنی بر PCR، توالی‌یابی و qPCR مناسب است، هرچند خلوص پایین‌تر آن برای آزمون‌های کمی با حساسیت بالا نیازمند توجه دقیق است.

متن کامل اصلی